ሞለኪውላር ባዮሎጂካል ምርምር ዘዴዎች በዘመናዊ ሕክምና፣ፎረንሲክስ እና ባዮሎጂ ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ። ለዲኤንኤ እና አር ኤን ኤ ጥናት እድገት ምስጋና ይግባውና አንድ ሰው የሰውነትን ጂኖም በማጥናት የበሽታውን መንስኤ ምን እንደሆነ ማወቅ, የተፈለገውን ኑክሊክ አሲድ በአሲድ ድብልቅ ውስጥ ወዘተ …ማወቅ ይችላል.
ሞለኪውላር ባዮሎጂካል ምርምር ዘዴዎች። ምንድን ነው?
በ70ዎቹ እና 80ዎቹ ዓመታት ውስጥ ሳይንቲስቶች ለመጀመሪያ ጊዜ የሰውን ልጅ ጂኖም በመለየት ተሳክቶላቸዋል። ይህ ክስተት ለጄኔቲክ ምህንድስና እና ለሞለኪውላር ባዮሎጂ እድገት መነሳሳትን ሰጥቷል. የዲኤንኤ እና አር ኤን ኤ ባህሪያት ጥናት አሁን በሽታን ለመመርመር እነዚህን ኑክሊክ አሲዶች መጠቀም ተችሏል, ጂኖችን ያጠኑ.
ዲኤንኤ እና አር ኤን ኤ በማግኘት ላይ
ሞለኪውላር ባዮሎጂካል ምርመራ ዘዴዎች የመነሻ ቁሳቁስ መኖሩን ይጠይቃሉ፡ ብዙ ጊዜ ኑክሊክ አሲዶች ናቸው። እነዚህን ንጥረ ነገሮች ከህያዋን ፍጥረታት ሴሎች ለመለየት ብዙ መንገዶች አሉ። እያንዳንዳቸው የራሳቸው ጥቅሞች እና ጉዳቶች አሏቸው, እና አስፈላጊ ነውንጹህ ኑክሊክ አሲዶችን ለመለየት ዘዴን በሚመርጡበት ጊዜ ግምት ውስጥ ያስገቡ።
1። በማርሙር መሰረት ዲ ኤን ኤ ማግኘት. ዘዴው የተደባለቀ ንጥረ ነገሮችን ከአልኮል ጋር ማከምን ያካትታል, በዚህም ምክንያት ንጹህ ዲ ኤን ኤ ይወርዳል. የዚህ ዘዴ ጉዳቱ ጠበኛ የሆኑ ንጥረ ነገሮችን መጠቀም ነው፡ ፌኖል እና ክሎሮፎርም።
2። በ Boom መሠረት የዲ ኤን ኤ ማግለል. እዚህ ጥቅም ላይ የሚውለው ዋናው ንጥረ ነገር ጓኒዲን ቲዮሲያኔት (GuSCN) ነው. በልዩ ንጥረ ነገሮች ላይ ለዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ዝናብ አስተዋጽኦ ያደርጋል ፣ ከዚያ በኋላ ልዩ ቋት በመጠቀም ሊሰበሰብ ይችላል። ነገር ግን GUSCN የ PTC ን የሚገታ ነው፣ እና ወደ ተፋጠነ ዲ ኤን ኤ ውስጥ የገባ ትንሽ ክፍል እንኳን የ polymerase chain reaction ሂደት ላይ ተጽእኖ ሊያሳድር ይችላል ይህም ከኒውክሊክ አሲዶች ጋር አብሮ ለመስራት ትልቅ ሚና ይጫወታል።
3። የቆሻሻ መጣያ. ዘዴው ከቀደምቶቹ የሚለየው የዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ሞለኪውሎች ሳይሆኑ ቆሻሻዎች ናቸው. ይህንን ለማድረግ, ion exchangers ጥቅም ላይ ይውላሉ. ጉዳቱ ሁሉም ንጥረ ነገሮች መዘንበል አለመቻላቸው ነው።
4። የጅምላ ማጣሪያ. ይህ ዘዴ ስለ ዲ ኤን ኤ ሞለኪውል ስብጥር ትክክለኛ መረጃ በማይፈለግበት ጊዜ ጥቅም ላይ ይውላል ፣ ግን አንዳንድ ስታቲስቲካዊ መረጃዎችን ማግኘት አስፈላጊ ነው። ይህ የተገለፀው የኑክሊክ አሲድ አወቃቀር በተለይ በአልካላይስ ሳሙና ሲታከም ሊጎዳ እንደሚችል ነው።
የምርምር ዘዴዎች ምደባ
ሁሉም የሞለኪውላር ባዮሎጂያዊ ምርምር ዘዴዎች በሦስት ትላልቅ ቡድኖች ይከፈላሉ፡
1። ማጉላት (ብዙ ኢንዛይሞችን በመጠቀም). እዚህPCR - polymerase chain reactionን ይመለከታል፣ እሱም በብዙ የመመርመሪያ ዘዴዎች ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል።
2። ማጉላት ያልሆነ። የዚህ ቡድን ዘዴዎች ከኑክሊክ አሲዶች ድብልቅ ስራዎች ጋር በቀጥታ የተገናኙ ናቸው. ምሳሌዎች 3 ብሎቶች፣ በቦታ ማዳቀል፣ ወዘተ ናቸው።
3። ከአንድ የተወሰነ መፈተሻ ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ ጋር የሚያገናኘውን የመርማሪ ሞለኪውል ምልክት በማወቅ ላይ የተመሰረቱ ዘዴዎች። ለምሳሌ Hybride Capture System (hc2) ነው።
በሞለኪውላር ባዮሎጂ የምርምር ዘዴዎች ውስጥ ጥቅም ላይ ሊውሉ የሚችሉ ኢንዛይሞች
ብዙ ሞለኪውላዊ የመመርመሪያ ዘዴዎች ሰፋ ያለ ኢንዛይሞችን መጠቀምን ያካትታሉ። ከታች በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉት ናቸው፡
1። ገደብ ኢንዛይም - የዲኤንኤ ሞለኪውል ወደ አስፈላጊ ክፍሎች "ይቆርጣል".
2። ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ - ባለ ሁለት ገመድ የዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ሞለኪውል ያዋህዳል።
3። በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴስ (እንደገና ይገለበጥ) - በአር ኤን ኤ አብነት ላይ ዲኤንኤን ለማዋሃድ ይጠቅማል።
4። ዲ ኤን ኤ ሊጋዝ - በኑክሊዮታይድ መካከል ፎስፎዲስተር ቦንድ እንዲፈጠር ኃላፊነት አለበት።
5። Exonuclease - ኑክሊዮታይድን ከዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ሞለኪውል የመጨረሻ ክፍል ያስወግዳል።
PCR ዋናው የዲኤንኤ ማጉላት ዘዴ ነው
Polymerase chain reaction (PCR) በዘመናዊ ሞለኪውላር ባዮሎጂ በንቃት ጥቅም ላይ ይውላል። ይህ እጅግ በጣም ብዙ ቅጂዎች ከአንድ የዲኤንኤ ሞለኪውል (ሞለኪውሎች ተጨምረዋል) የሚገኝበት ዘዴ ነው።
የ PCR ዋና ተግባራት፡
- ምርመራዎችበሽታዎች፤
- የዲኤንኤ ክፍሎች፣ ጂኖች ክሎኒንግ።
የፖሊሜራዝ ሰንሰለት ምላሽን ለማካሄድ የሚከተሉት ንጥረ ነገሮች ያስፈልጋሉ፡ የመጀመርያው የዲ ኤን ኤ ሞለኪውል፣ ቴርሞስታብል ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ (ታክ ወይም ፒፉ)፣ ዲኦክሲራይቦኑክሊዮታይድ ፎስፌትስ (የናይትሮጅን መነሻዎች)፣ ፕሪመር (2 primers በ 1 ዲኤንኤ ሞለኪውል)) እና ሁሉም ምላሾች የሚቻሉበት የመጠባበቂያ ስርዓቱ ራሱ።
PCR ሶስት እርከኖችን ያቀፈ ነው፡ denaturation፣ primer annealing and elongation።
1። ዲናትዩሽን በ94-95 ዲግሪ ሴልሺየስ የሙቀት መጠን በዲ ኤን ኤ መካከል ያለው የሃይድሮጅን ቦንድ ፈርሷል፣በዚህም ምክንያት ሁለት ነጠላ-ፈትል ያላቸው ሞለኪውሎች እናገኛለን።
2። ፕሪመር ማስታገሻ. ከ50-60 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ባለው የሙቀት መጠን፣ ፕሪመር በነጠላ-ክር ከተደረደሩ ኑክሊክ አሲድ ሞለኪውሎች ጫፍ ላይ በማሟያነት አይነት ተያይዟል።
3። ማራዘም. በ72 ዲግሪ በሚገኝ የሙቀት መጠን ሴት ልጅ የዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ሞለኪውሎች ውህደት ይከሰታል።
የዲኤንኤ ቅደም ተከተል
የሞለኪውላር ባዮሎጂካል ምርምር ዘዴዎች ብዙውን ጊዜ በዲኦክሲራይቦኑክሊክ አሲድ ሞለኪውል ውስጥ ስላለው የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል እውቀት ያስፈልጋቸዋል። የጄኔቲክ ኮድን ለመወሰን ቅደም ተከተል ይከናወናል. የወደፊቱ ሞለኪውላር ምርመራዎች በሰዎች ቅደም ተከተል በተገኘው እውቀት ላይ የተመሠረተ ይሆናል።
የሚከተሉት የቅደም ተከተል ዓይነቶች ተለይተዋል፡
- ማክም-ጊልበርት ቅደም ተከተል፤
- Sanger ቅደም ተከተል፤
- pyrosequencing፤
- ናኖፖሬቅደም ተከተል።
